A ordem do caos

Em muitas situações, a resposta morfogênica ocorre de maneira indireta, ou seja,a partir de calos e agregados celulares.

Os calos podem ser considerados como agrupamentos de células em mitoses sucessivas. Diferente do que possa parecer, os calos podem apresentar uma certa diferenciação em sua estrutura, sendo observado em alguns tipos de calos a diferenciação de tecidos vasculares.

Os calos podem ser classificados em dois grupos:

1) calos friáveis, os quais possuem as células mais facilmente separáveis umas das outras, de formato arredondado e tamanho pequeno. Estas células tem características mais meristemáticas e possuem maior proporção de substâncias pécticas e hemicelulósicas. A coloração destes calos varia do amarelo ao bege. Calos friáveis são promissores quando se busca a embriogênese somática. Esse tipo de calo também pode ser utilizado para se iniciar uma cultura de suspensão celular.

*Fig 1 - Calo embriogênico em explante de urucum

2) calos compactos, os quais possuem elementos mais diferenciados com células vacuoladas e parede mais espessa. Como a própria nomenclatura revela, nesses calos as células estão mais unidas formando camadas compactas e coesas. Calos compactos tendem a resposta organogênica.

*Fig 2 - Calo compacto em explante foliar de Eucalyptus

As células do calo podem apresentar morfologia, tamanho, coloração e ploidia variada, dependendo da espécie, período de cultura e composição do meio de cultivo.

A cultura de calos pode ser empregada na produção de metabólitos secundários que são produzidos constitutivamente.

O grande problema envolvido na calogênese é que como se tem uma condição de múltiplas divisões, a ocorrência de variações e mutações, tende a aumentar, levando as variações somaclonais, que serão abordadas em outro post.

Morfogênese - o principio de tudo

Como dito no primeiro post, a totipotência é o pilar principal da cultura de tecidos.

Toda célula vegetal, que apresente núcleo, possui a capacidade de regenerar uma nova planta, desde que mantida em condições adequadas para tal.

O processo que leva a regeneração de uma planta é conhecido como morfogênese.

Durante a morfogênese há vários estágios que conduzem a diferenciação e especialização das células, em tecidos e orgãos.

Outros fundamentos da cultura de tecidos são a determinação e a competência celular, sendo que estes dois conceitos interagem. A competência refere-se à capacidade da célula em seguir por uma rota morfogênica especificada. A determinação refere-se ao grau de “compromisso” da célula com uma rota morfogênica.

Exemplificando, uma célula de raiz é altamente determinada para a formação de tecido radicular, entretanto, caso a célula seja colocada em condições e meio de cultura corretos que vissem modificar sua rota morfogênica, esta célula se mostrará competente para a formação do tecido desejado.

A cultura de tecidos pode ser dividida em três formas: multiplicação de gemas axilares e ápices caulinares, morfogênese direta e morfogênese indireta. A divisão entre morfogênese direta e indireta se dá pela presença ou não da etapa de calo, ou seja, aglomerado de células indiferenciadas em mitoses sucessivas. A morfogênese é dividida em organogênese e embriogênese somática sendo que estas duas podem ser diferenciadas pelo tipo de formação e organização celular.

Extraido de http://www.cca.ufsc.br/lfdgv

Gottileb Haberlandt (1854-1945)

Nascido no império austro-húngaro em 1854, na cidade de Ungarisch-Altenburg (atual Mosonmagyaróvár) situada ao nordeste da atual Hungria. 

Gottilieb Haberlandt é considerado o pai da cultura de tecidos vegetais e foi um visionário ao propor o conceito da totipotência, pilar fundamental da cultura de tecidos. Em 1902, ele formulou a hipótese de que uma célula vegetal somática individualizada teria a capacidade de regenerar uma planta completa. Infelizmente não logrou exito em seus trabalhos, por faltar em seus meios de cultivo a presença de substâncias reguladoras do desenvolvimento vegetal, como auxinas e citocininas.

Haberlandt formou-se pela Universidade de Viena, tendo passagens pelas Universidade de Tecnologia de Graz (Technische Universitat Graz) e Universidade de Berlim. Seu principal mentor foi o botânico suíço Simon Schwendener.

O talento nato para o desenho era uma de suas características, sendo uma habilidade preciosa para seus estudos em anatomia vegetal. Em seus estudos com fisiologia vegetal, desenvolveu pesquisas a respeito do crescimento apical, elementos vasculares e a translocação de assimilados.

Haberlandt não foi o primeiro a tentar cultivar tecidos vegetais. Anteriormente Irmisch (1858), Sachs (1859) e Koch (1887) trabalharam com tecidos embrionários, no caso cotilédones, e conseguiram plantas inteiras. Porém nenhum trabalho logrou exito a partir de células somáticas. 

Haberlandt trabalhou com células isoladas do mesófilo de Lamium purpureum e células do estame de Tradescantia virginica, sendo que estas células permanecerem vivas por várias semanas, contudo sem a ocorrência de divisões celulares. O modo como se induziria essas divisões celulares foi  o grande questionamento levantado em seus estudos, propondo que "enzimas de crescimento" teriam este papel. 

Em 1913, Haberlandt provou a existência de fatores da divisão celular em plantas, classificando em duas classes: lepto-hormônios e necro-hormônios. Os lepto-hormônios estavam associados aos tecidos vasculares, enquanto os necro-hormônios estavam associados a injuria e morte de células. Pela primeira vez estabeleceu-se a teoria de hormônios em botânica, culminando com a descoberta da cinetina e outras citocininas.

Gottilieb Haberlandt faleceu em 1945 ao final da segunda guerra mundial, sendo que várias de suas notas pessoais, manuscritos, cartas, documentos e livros foram destruídos durante bombardeios em Berlim. De qualquer forma sua contribuição para a ciência tornou-se eterna e será sempre lembrada.

Referências:

Hoxtermann E (1997) Physiologia Plantarum 100: 716-728.

Noé AC (1938) Plant Physiology : 850-855.

Micropropagação

A forma de aplicação mais difundida e conhecida da cultura de tecidos vegetais é a micropropagação ou propagação in vitro. Este termo foi utilizado primeiramente em 1975 e passou a ser empregado para definir os processos de propagação vegetativa na cultura de tecidos vegetais.

Na micropropagação se busca a multiplicação de gemas axilares e ápices caulinares, ou seja, a utilização de células meristemáticas já formadas.

A utilização da micropropagação tem favorecido áreas como a fruticultura, floricultura e florestal por permitir a produção de grande quantidade de mudas em curto espaço de tempo. Como exemplo temos que um rizoma de bananeira no sistema in vitro permite a obtenção de 800 a 1000 mudas, ao passo que via técnicas convencionais de propagação seria obtidas apenas 6 mudas. Se considerarmos a aplicação da embriogênese somática, este patamar de multiplicação se eleva em muitas vezes, entretanto isso é assunto para outro post. 

A micropropagação permite, além do curto intervalo de tempo para produção da muda e de pequeno espaço físico, a obtenção de mudas livre de patógenos e viroses, lembrando sempre que são mudas clonais, com conhecido potencial agronômico.

A micropropagação pode ser dividida em quatro etapas principais: introdução e estabelecimento da cultura in vitro; multiplicação; alongamento e enraizamento, e aclimatização. Podem ocorrer variações de acordo com a espécie vegetal e seu comportamento in vitro.

Esquema geral da micropropagação (Extraido de George et al. 2003)

Antes mesmo de dar início ao processo in vitro é necessário atenção a planta matriz doadora de explantes em seus aspectos fisiológicas, nutricionais e sanitários. Isto significa que pode ser necessário modificar as condições de fotoperíodo e temperatura, a aplicação de planta fitorreguladores do grupo das giberelinas e auxinas, alterando com isto a sua condição fisiológica. Tratamentos como podas, indução do estiolamento e estaquias em cascatas também são abordagens que podem ser realizadas.

Durante o estabelecimento da cultura nas condições in vitro são fundamentais: a escolha adequada do explante; o protocolo de desinfestação que permita o controle dos contaminantes sem causar grandes danos ao explante; as condições de incubação da cultura; a metodologia de esterilização do meio de cultura e demais vasilhames.

Neste estágio torna-se necessário monitorar e controlar as reações de oxidação que ocorrem: pelos compostos fenólicos presentes no explante, como resposta ao ferimento provocado pela excisão de um órgão ou tecido e, pela síntese de compostos mono e poliméricos por parte do explante. A incubação destas culturas na ausência da luz por alguns dias pode inibir estes processos oxidativos.

 Na etapa seguinte temos a multiplicação das gemas pré existentes e a indução de gemas adventícias. Esta etapa é fundamentada na divisão e diferenciação celular, de acordo com as diferentes rotas morfogenéticas possíveis, como a organogênese e a embriogênese somática, de modo direto ou indireto. Neste estágio deve-se determinar o número e intervalo de sub-cultivos, bem como determinar e otimizar a taxa de multiplicação.

O próximo estágio é o alongamento e enraizamento das plantas obtidas in vitro. Para algumas plantas não é necessária esta etapa, uma vez que as raízes são naturalmente formadas, Neste estágio busca-se a preparação das plantas para a conversão das condições heterotróficas para autotróficas e as condições ex vitro em geral. As estratégias incluem eventuais inclusões ao meio de cultura de ácido giberélico para induzir o alongamento de eixos caulinares; auxinas (em especial o ácido indol butírico - AIB) para induzir a iniciação radicular; incorporação de carvão ativado para favorecer a iniciação radicular; reduções nas concentrações dos sais e das fontes de carboidratos do meio de cultura, promovendo a iniciação radicular, bem como facilitando o processo de aclimatização.

O último estágio refere-se a aclimatização, quando as plantas saem da condição in vitro para a condição ex vitro. Neste estágio ocorre a transição da condição heterotrófica para autotrófica. O principal objetivo neste estágio é reduzir ao máximo as perdas que ocorrem principalmente pela desidratação dos tecidos da microplanta. 

De modo extremamente reduzida, essa é uma descrição a respeito da micropropagação. Para cada uma das etapas temos inúmeros aspectos que serão abordados com a devida profundidade futuramente no blog.

Referências:
George EF, Hall MA, DeKlerk G (2008) Plant Propagation by Tissue Culture - vol1 The Background- 3rd Edition, Springer 

A ciência e a arte da cultura de tecidos vegetais

Já parou para pensar em como é possível uma semente minúscula, como a semente de eucalipto, dar origem a uma árvore de tão grande porte e tamanho? Ou como é possível que para determinadas plantas se possa retirar um pedaço, um galho ou uma  folha, e a partir deles multiplicar essa planta?

Quando você observa arbustos moldados por topiaria, com diferentes formatos, após várias podas, já parou para pensar na capacidade de regeneração que uma planta apresenta?

É justamente a respeito desta "habilidade" intrínseca das plantas, que a cultura de tecidos vegetais tem como seu pilar fundamental. Esta habilidade é conhecida como totipotência celular e pode ser entendida como a capacidade de praticamente toda célula vegetal em gerar um novo indivíduo completo, a princípio com as mesmas caracteristicas da planta-matriz.

A cultura de tecidos vegetais é a ciência que busca conduzir o desenvolvimento de células, tecidos e orgãos vegetais, em um ambiente estéril, induzindo a uma via de interesse, seja ela, a propagação de espécies, a produção de híbridos, poliplóides ou haplóides, indução de mutações, dentre outras.

A cultura de tecidos é uma ferramenta valiosa para várias áreas cientificas, tais como estudos de expressão gênica, estudos fisiológicos, transformação genética; além de várias aplicações técnicas tal como a micropropagação, a conservação de germoplasmas, produção de sementes sintéticas e produção de metabólitos secundários.

O objetivo do blog será discorrer a respeito da cultura de tecidos vegetais em sua totalidade, discutindo desde os aspectos mais básicos aos mais avançados, além de um resgate histórico sobre a técnica, no Brasil e no mundo, bem como o panorama atual.